Kromato grafi lapis tipis

Pengertian klt
Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan senyawa secara cepat, dengan menggunakan zat penjerap berupa serbuk halus yang dipaliskan serta rata pada lempeng kaca. Lempeng yang dilapis, dapat dianggap sebagai “kolom kromatografi terbuka” dan pemisahan dapat didasarkan pada penyerapan, pembagian atau gabungannya, tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis pelarut.

2.2.2.Prinsip Kromatografi Lapis Tipis
Prinsipnya didasarkan atas partisi dan adsorpsi. Zat penjerap merupakan fase stasioner, berupa bubuk halus dibuat serba rata dan tipis diatas lempeng kaca. Fase diam yang umum digunakan adalah silika gel, baik yang normal fase maupun reversed fase
Kromatografi lapis tipis dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis tidak tetap, jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi kertas. Oleh karena itu pada lempeng yang sama di samping kromatogram zat yang di uji perlu dibuat kromatogram zat pembanding kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda.
2.2.3.Cara Kerja Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisikokimia.  Lapisan yang memisahkan, yang terdiri atas bahan  berbutir – butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan , ditotolkan berupa berupa bercak atau pita (awal).  Setelah plat atau lapisan ditaruh didalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok.
Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler. Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.
Untuk campuran yang tidak diketahui, lapisan pemisah (sifat penjerap) dan   sistem larutan pengembang harus dipilih dengan tepat karena keduanya bekerjasama untuk mencapai pemisahan.  Selain itu hal yang juga penting adalah memilih kondisi kerja yang optimum yang meliputi sifat pengembangan, jarak pengembangan , atmosfer bejana  dan lain- lain. Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf.
                                 Rf     =  Jarak titik pusat bercak dari titik awal
                                                Jarak garis depan dari titik awal
Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal. hRf  adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berjangka 0 – 100. Jika keadaan luar misalnya sifat penjerap yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram yang secara umum menunjukkan angka Rf lebih rendah atau lebih tinggi, maka sistem pelarut harus diganti dengan yang lebih sesuai. Jika angka hRf lebih tinggi dari hRf yang dinyatakan, kepolaran pelarut harus dikurangi, jika hRf lebih rendah maka komponen polar pelarut harus dinaikkan.
Sifat – sifat umum dari penyerap -  penyerap untuk kromatografi lapis tipis yaitu besar partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada mereka. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1 – 25 mikron . Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya halus. Kebanyakan penyerap yang digunakan adalah silika gel. Silika gel yang digunakan kebanyakan diberi pengikat yang dimaksudkan untuk memberi kekuatan pada lapisan dan menambah adhesi pada gelas penyokong. Pengikat yang digunakan kebanyakan kalsium sulfat. Tetapi biasanya dalam perdagangan silika gel telah diberi pengikat. Jadi tidak perlu mencampur sendiri dan diberi nama dengan kode silika gel G.
Gambar Kromatografi Lapis Tipis
Bahan adsorben sebagai fasa diam digunakan silica gel, alumina, dan serbuk selulosa. Partikel silica gel mengandung gugus hidroksil di permukaannya yang akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul -molekul polar. Alumina lebih disukai untuk memisahkan senyawa -senyawa polar lemah, sedangkan silica gel lebih disukai untuk memisahkan molekul-molekul seperti asam-asam amino dan gula. Magnesium silikat, kalsium silikat, dan arang aktif mungkin juga dapat digunakan sebagai adsorben.
Zat yang paling umum digunakan sebagai adsorben adalah alumina, silica gel, dan bubuk silica. Zat - zat tersebut dibuat bubuk tepung yang selanjutnya tersebar di atas lempeng dan dibuat sedemikian rupa hingga ketebalannya merata. Kadang - kadang suatu pengikat, misalnya plaster parte ditambahkan untuk menambah daya lekat zat tersebut. Setelah kering, selanjutnay diaktivasi dengan pemanasan dalam oven pada temperature 110oC selama beberapa jam. Cara kerjanya sama dengan kromatografi kertas. Deteksi terhadap noda timbul kadang-kadang lebih mudah dibandingkan kromatografi kertas karena dapat dipakai cara-cara yang lebih umum.
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si.
Eluen pengembang dapat berupa pelarut tunggal dan campuran pelarut dengan susunan tertentu. Pelarut - pelarut pengembang harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Terdapatnya sejumlah kecil air atau zat pengotor lainnya dapat menghasilkan kromatogram yang tidak diharapkan.
          Analisis dengan KLT dapat digunakan untuk mengidentifikasi simplisia yang kelompok kandungan kimianya telah diketahui. Kelompok kandungan kimia tersebut antara lain :
1)Alkaloid
2)Antraglikosida
3)Arbutin
4)Glikosida Jantung
5)Zat pahit
6)Flavonoid
7)Saponin
8)Minyak atsiri
9)Kumarin dan asam fenol karboksilat
10)Valepotriat
Pereaksi penampak
Pereaksi penampak adalah larutan pereaksi yang digunakan untuk menyemprot lempeng KLT agar bercak yang terjadi dapat jelas terlihat.
a)Anisaldehid-asam sulfat P
Untuk mengamati minyak atsiri, saponin, zat pedas dan lain-lain.
b)Dragendroof
Untuk mengamati alkaloid.
c)Antimon (III) klorida
Untuk mengamati glikosida jantung, saponin.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam KLT :
a)Lempeng yang akan digunakan harus diaktifkan terlebih dahulu agar pada proses elusi lempeng silica gel dapat menyerap dan berikatan dengan sampel. Pengaktifan lempeng dilakukan dalam oven pada suhu 1100C selama 30 menit.
b)Chamber harus dijenuhkan untuk menghilangkan uap air atau gas lain yang mengisi fase penjerap yang akan menghalangi laju eluen.
c)Pada saat penotolan, hendaknya sampel jangan terlalu pekat sebab pemisahannya akan sulit sehingga didapat noda berekor.
d)Penotolan harus tepat sehingga didapatkan jumlah noda yang baik.
e)Eluen yang digunakan harus murni sehingga tidak menghasilkan noda lain.
2.2.4.Noda Pada Kromatografi Lapis Tipis
Mekanisme panampakan noda pada UV yaitu suatu molekul yang mengabsorbsi cahaya ultraviolet akan mencapai suatu keadaan tereksitasi dan kemudian memancarkan cahaya ultraviolet atau cahaya tampak pada waktu kembali ke  tingkat dasar (emisi), emisi inilah yang digambarkan sebagai fluoresensi.
Prinsip pemisahan noda adalah berdasarkan kepolarannya sehingga menghasilkan kecepatan yang berbeda - beda saat terpartisi dan terjadilah pemisahan. Untuk memisahkan noda dengan sebaik-baiknya maka digunakan kombinasi eluen non polar dengan polar. Apabila noda yang diperoleh terlalu tinggi, maka kecepatannya dapat dikurangi dengan mengurangi kepolaran. Namun apabila nodanya lambat bergerak atau hanya ditempat, maka kepolaran dapat ditambah.
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatrografi lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf :
a.Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
b.Sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya.
c.Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
d.Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak
e.Derajat kejenuhan dari uap dalam mana bejana pengembangan yang digunakan
f.Teknik percobaan, Arah dalam mana pelarut bergerak di atas plat.
g.Jumlah cupilkan yang digunakan, Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan.
h.Suhu, Pemisahan-pemisahan sebaiknya dilakukan pada suhu tetap,
i.Kesetimbangan, Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut.
Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor disebabkan karena :
·Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak tepat
·Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa
·Lempeng yang tidak rata
2.2.5.Kelebihan dan Manfaat Kromatografi Lapis Tipis
a.Kelebihan Kromatografi Lapis Tipis
Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis yaitu :
·lebih cepat dan lebih reproducible dari kromatografi kertas,
·untuk menyempurnakan pemisahan,
·lempeng dapat dibuat dengan campuran adsorben yaitu campuran homogen dari beberapa adsorben, satu lempeng dilapisi dengan adsorben yang berbeda-beda, satu lempeng dilapisi dengan campuran dua adsorben dengan konsentrasi bervariasi dari 0 % ke 100 % untuk adsorben yang satu dari ujung lempeng yang satu ke ujung lempeng yang lain dan sebaliknya,
·area dari bercak lebih kompak dan jenis spray-reagents lebih banyak termasuk yang bersifat korosif dapat digunakan bila adsorben bukan selulosa.
b.Manfaat Kromatografi Lapis Tipis
Adapun manfaat dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yaitu :
·Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa obat.
·Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman.
·Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat.
·Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif campuran senyawa obat.

C. PENGEMBANGAN KROMATOGRAFI
Bila plat kromatografi telah disiapkan dan cuplikan telah ditempatkan di atasnya, maka ia dimasukkan dalam bejana yang cocok dengan ujung yang paling bawah, dimana cuplikan detempatkan, dicelupkan dalam fase bergerak yang telah dipilih sedalam kira-kira 0,5-1,0 cm. Biasanya dua plat dapat dimasukkan dalam bejana, dalam hal ini akan diperoleh kromatografi penaikan. Bejana diusahakan jangan sampai bocor. Sering tidak memerlukan waktu kesetimbangan, tetapi untuk meyakinkan homogenitas dari atmosfer dalam bejana, maka dinding dalam bejana dilapisi dengan lembaran kertas saring yang ujungnya direndam dalam fase gerak. Sedapat mungkin menggunakan bejana yang sekecil mungkin, sehingga atmosfer dalam bejana mempunyai volume sekecil mungkin. Untuk plat kaca yang kecil, microscope slide, sebagai bejana dapat dipakai gelas piala yang mempunyai kapasitas sekitar 500 ml, juga dinding sebelah dalamnya dapat dilapisi dengan kertas saring yang ujungnya dicelupkan dalam fase gerak. Permukaan pelarut yang terdapat di dalam jangan sampai terhubung dengan atmosfer luar, karena hal ini mengakibatkan komponen-komponen yang mudah menguap lepas oleh penguapan
Pengembangan menurun atau horisontal dapat digunakan dalam beberapa kasus,yaitu pada lapisan tebal atau dengan fase gerak kental. Fase gerak dialirkan pada lapisan melalui kertas saring. Pengembangan horisontal bisanya digunakan pada KLTET. Untuk memperbaiki pemisahan dapat dilakukan teknik sebahgai berikut:
1. Pengembangan Berlanjutan
Fase gerak dialirkan pada bagian atas dari lempeng pengembangan horisontal dan diisap oleh fase diam. Teknik ini terutama digunakan untuk senyawa yang mempunyai harga Rf 0,05-0,2 setelah pengembangan pertama.
2. Pengembangan Dua Dimensi
Cuplikan ditotolkan pada lempeng 3-4 cm dari salah satu pojok dan dikembangkan seperti biasanya. Lempeng kemudian diputar 90o sehingga pita pemisahan dari hasil pengembangan pertama terletak pada bagian bawah lempeng, dan kemudian dilakukan pengembangan kedua. Fase gerak harus diganti sehingga diperoleh pengaruh pemisahan berbeda pada arah kedua. Teknik ini berguna untuk cuplikan yang mengandung banyak senyawa penyusun.
3. Pengembangan Sirkuler
Pada kromatografi sirkuler fase gerak dialirkan dengan sebuah sumbu atau pompa melalui pipa kapiler di tengah lapisan fase diam. Senyawa terlarut bergerak cepat dari tengah penotolan menghasilkan lingkaran-lingkaran sempit.
4. Pengembangan Beberapa Kali
Pada fase gerak biasanya mudah menguap dapat diuapkan setelah pengembangan dan lempeng itu spat dikembangkan lagi dengan fase gerak sama atau fase gerak lain. Teknik ini dinamakan pengembangan beberapa kali. Bercak cuplikan berbentuk bulat telur dengan aksisi pendek kepada arah fase gerak bergerak.
5. Metode Identifikasi
Untuk melihat senyawa tak berwarna pada lempeng, biasanya digunakan metode sebagai berikut:
a. Melihat kromatografi di bawah sinar ultraviolet (254 atau 366 nm)
• Pada lapisan berfluoresensi, misalnya Silica gel GF254, bercak muncul sebagai noda hitam.
• Untuk senyawa berfluoresensi digunakan lapisan biasa, bercak terlihat berfluoresensi.
b. Menyemprot dengan pereaksi yang menghasilkan warna dan atau berfluoresensi.
6. KLT Preparatif
Pemisahan preparatif sering dilakukan pada lapisan yang agak tebal (0,5-2,0 mm). Cuplikan ditotolkan sebagai garis sempit dengan alat yang sesuai. Ukuran maksimum cuplikan tergantung pada jumlah relatif senyawa penyusun, perbedaan Rf-nya dan lebar lempeng. Jika selisih harga Rf lebih besar dari 0,2 dapat ditotolkan 50-1—mg cuplikan pada lempeng 20 cm.

IV. CONTOH PERCOBAAN TEKNIK KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

A. PEMBUATAN LAPIS TIPIS KECIL
1. Dua buah mikroskop yang dilekatkan satu sama lain dicelupkan dala bubur silika gel. (Bubur silika gel dibuat dengan mencampurkannya dengan klofoform yang diaduk hingga benar-benar homogen)
2. Setekah dicekupkan diangkat kembali, biarkan hingga kering di udara. Setelah kering bagian sisi yang terletak disebelah dalam dari masing-masing gelas dibersihkan dengan kertas kering.

B. PEMBUATAN LAPIS TIPIS BESAR
1. Timbang silika gel sebanyak 12 gram, tambahkan air sebanyak 27 ml, diaduk sampai homogen. (Air yang digunakan adalah air suling)
2. Tuangkan pada gelas preparat besar ukuran 20x20 cm dan usahakan mendapatkan tebal permukaan yang serata mungkin dengan cara mengetap-ngetapkan di atas gabus.
3. Plat gelas yang telah dilapisi silika gel dikeringkan untuk di ”aktif” kan dengan jalan memanaskan dalam oven pada suhu sekitar 100oC selama 30 menit (semakin lama semakin baik).

C. PEMBUATAN CUPLIKAN
Dipakai zat dari tumbuh-tumbuhan misal kunir, daun atau bunga-buangaan, dapat juga zat organik yang tak berarna.
1. Kunir, daun atau buanga dipotong-potong dan dilumatkan sampai halus dalam lumpang porselin dan diekstrak dengan pelarut organik, kloroform (dapat menggunakan pelarut lain).
2. Ekstrak disaring, ambil bagian yang terlarut dalam kloroform kemudian diuapkan hingga diperoleh larutan yang pekat.

D. PEMBUATAN KROMATOGRAM
1. Di atas lapisan tipis teteskan zat yang akan dikromatografikan dengan pipa kapiler, pada jarak kira-kira 1 cm dari bagian bawah kaca. Untuk plat yang kecil noda berupa titik sedang plat yang besar, 20x20 cm berupa deretan titik-titik sehingga menbentuk garis. Biarkan beberapa saat hingga kering.
2. Lapisan tipis yang mengandung cuplikan dimasukkan dalam suatu bejana yang berisi fase gerak. (Untuk lapisan tipis yang kecil dapat ditempatkan dalam gelas piala). Bagian yang mengandung cuplikan dicelupkan dalam fase bergeak, noda jangan sampai tercelup dalam fase bergerak.
3. etelah fase bergerak naiksampai hampir ujung atas lapisan, lapisan tipis diambil dari bejana/gelas piala. Untuk plat kecil, batas fase bergerak dan noda-noda diberi tanda. Biarkan kering diudara.
4. Untuk mengetahui lokasi noda (bila noda tidak kelihatan), maka setelah lapisan tipis kecil kering dimasukkan dalam gelas piala yang di dalamnya telah diberi kristal yood.
5. Tentukan harga Rf untuk lapisan tipis yang kecil.
6. Penanganan plat yang besar selanjutnya.
Bila dikehendaki untuk mendapatkan hasil pemisahan maka pita-pita yang merupakan komponen-komponen senyawa masing-masing dikeruk dan dikumpulkan secara terpisah. Tiap-tiap bagian dicuci dengan kloroform yang kemudian perlu diuji lebih lanjut, dengan menggunakan lapisan tipis, untuk mengetahui apakah masing-masing bagian merupkan komponen tunggal atau masih merupakan campuran.

Pereaksi semprot
Komposisi
Perlakuan
Keterangan
Vanilin asam sulfat
1 gram vanilin dalam asam sulfat pekat
Disemprot dan dipanaskan hingga muncul warna
Pereaksi umum yang digunakan. Terpen akan menghasilkan warna merah atau biru
Asam fosfomolibdat
Asam fosfomolibdat 5% b/v dalam etanol
Disemprot dan dipanaskan hingga muncul warna
Untuk mendeteksi terpen dengan bercak biru berlatar kuning
Reagen Dragendorff
10 mL larutan KI 40% ditambahkan dengan 10 mL larutan 0,85 gram bismuth subnitrat dalam 10 mL asam asetat dan 50 mL air. Larutan tersebut diencerkan dalam 10 mL asam asetat dan 50 mL air
Jika reaksi tidak spontan maka diperlukan pemanasan
Deteksi alkaloid menghasilkan warna oranye pekat hingga merah