makalah hplc

MAKALAH

HPLC

(High Performance Liquid Chromatography)

Disusun oleh

RINO RAMADHAN (27)

4 Kimia Analisis 3

SMK NEGERI 1 (STM PEMBANGUNAN) TEMANGGUNG

Jalan Kadar Maron, Kotak Pos 104, Telp/Fax. (0293) 4901639

Website :http://stembatema.sch.id. E-mail:smkn1_marontmg@yahoo.co.id

Temanggung 56221

DAFTAR ISI

Hal

DAFTAR ISI................................................................................................................ ii

KATA PENGANTAR................................................................................................. iii

BAB I : PENDAHULUAN.......................................................................................... 1

A. Latar Belakang.................................................................................................... 1

B. Rumusan Masalah............................................................................................... 1

C. Manfaat Penulisan............................................................................................. 2

BAB II : PEMBAHASAN............................................................................................. 3

A. Pengertian HPLC ................................................................................................ 3

B. Jenis-jenis HPLC.................................................................................................. 4

C. Instrumen atau Komponen HPLC ........................................................................ 6

D. Prinsip Kerja HPLC............................................................................................. 11

E. Bagian dan Fungsi AAS/SSA.............................................................................. 12

F. Perawatan HPLC.................................................................................................. 12

G. Kegunaan HPLC………………………………................................................... 13

H. Kelebihan dan Kekurangan HPLC…………………………................................ 13

I. Contoh Percobaan………………………………………………......................... 14

J. Analisis Kromatogram/ interpretasi data.............................................................. 18

BAB II : PENUTUP .................................................................................. 19

A. Kesimpulan ..........................................................................................19

B. Saran .....................................................................................................19

DAFTAR PUSTAKA..................................................................................19

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum Wr. Wb.

Puji syukur kami panjatkan kepada Alloh swt yang telah memberi kami rahmat dan karunia-Nya sehingga kami mampu menyelesaikan makalah ini dengan baik. Shalawat serta salam semoga terlimpah kepada junjungan kita Nabi Muhammad SAW.

Makalah yang saya susun ini berjudul “HPLC (High Performance Liquid Chromatography) “. Makalah ini kami susun dalam rangka memenuhi tugas sekolah.

Kami menyadari dalam penyusunan makalah ini masih jauh dari sempuna. Maka dari itu, kritik dan saran anda sangat kami nantikan. Terima kasih atas segala partisipasi semua pihak yang mendukung tersusunnya makalah ini. Atas segala kekurangan dan kesalahannya kami mohon maaf.

Wassalamu’alaikum Wr.wb

Temenggung, Juli 2018

Penyusun

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.

Pembahasan teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm^-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm³m^-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik.

B. Rumusan Masalah

Dari latar belakang diatas, penulis dapat merumuskan masalah sebagai berikut:

· Apa pengertian dari HPLC ?

· Apasajakah jenis-jenis HPLC ?

· Apasajakah komponen yang terdapat dalam HPLC ?

· Bagaimana prinsip dasar dari HPLC ?

· Bagaimana prinsip kerja dari HPLC ?

· Bagaimana perawtaan dari HPLC ?

· Apa kegunaan dari HPLC ?

· Apa kelebihan dan kekurangan dari HPLC ?

· Bagaimana contoh percobaan HPLC ?

C. Manfaat Penulisan

Adapun manfaat yang diharapkan dari penulisan makalah ini selain memenuhi tugas dari sekolah, juga bertujuan untuk memberi masukan ilmu pengetahuan bagi semua khalayak pada umumnya dan khususnya bagi penulis pribadi sehingga kedepannya dapat lebih mengetahui bagaimana metode maupun prinsip kerja dari HPLC.

BAB III

PEMBAHASAN

A. Pengertian HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat.

Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.

Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien.

Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi lainnya, antara lain :

· Cepat : waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.

· Resolusi tinggi : berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.

· Sensitivitas detektor : detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).

· kolom dapat digunakan kembali : berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai jenis sampel.

· Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah : zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat dianalisis secara KCKT.

· Mekanisme pemisahan lebih variatif : banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.

· Mudah rekoveri sampel :: umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor.

Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT memiliki beberapa kelemahan, yaitu :

· Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus

· Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.

Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis yang cepat.

Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:

· Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis

· Analisis ketidakmurnian (impurities)

· Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)

· Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion

· Isolasi dan pemurnian senyawa

· Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip

· Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

B. Jenis-jenis HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

· Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

· Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.

Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

· Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

· Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

· Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

· Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

C. Instrumen atau Komponen HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) , pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

· Wadah fase gerak (Reservoir)

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

o Fase Gerak

Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

o Persyaratan fase gerak HPLC:

1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.

2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi.

3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.

4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.

5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).

6. Sesuai dengan detector.

o Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

1. HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.

2. HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan fase gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.

Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’ pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5

· Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

o Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:

1. Pompa reciprocating

Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.

2. Pompa displacement

Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.

3. Pompa pneumatic

Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

· Tempat Injeksi

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL).

o Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

Parameter	Kolom konvensional	Kolom mikrobor
Tabung kolom	Stainless steel Panjang 3,10,15,20 dan 25 cm Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 4,6 cm	Stainless steel Panjang 25 dan 50 cm Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 1 atau 2 mm
Fase diam	Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase), atau polimer-polimer stiren/divinil benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5 atau 10µm dengan kisaran sempit.	Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase), atau polimer-polimer stiren/divinil benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5 atau 10µm dengan kisaran sempit.
Tekanan operasional	500-3000 psi (35-215 bar	1000-5000 psi (70-350 bar)
Fase gerak	Hidrokarbon+pelarut terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir : 1-3 ml/menit	Hidrokarbon+pelarut terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir 10-100 µl/menit.Modifikasi instrumen Sistem penghantaran pelarut yang mampu memberikan kontrol aliran di bawah 10µl/menit.Katup injeksi sampekl bervolume kecil;sel detektor bervolume kecil.
Kinerja	Efisiensi meningkat dengan bekurannya ukuran partikel fase diam, akan tetapi umur kolom dengan ukuran partikel 3 µm lebih pendek.	Sangat efisiensi dan sensitif, akan tetapi lambat,konsumsi fase gerak hanya ¼ dari kolom konvensional.

1. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

2. Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

3. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

o Syarat- syarat injektor yang baik :

1. Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin

2. Mudah digunakan

3. Keberulangan tinggi

4. Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

· Kolom

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :

1. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

2. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

3. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

4. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

5. Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

o Fase Diam

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

· Detektor

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;

2. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil;

3. stabil dalam pengopersiannya;

4. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;

5. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier);

6. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Karakteristik detector HPLC:

Dasar Pendeteksian	Jenis	Maksimum sensitifitas	Peka terhadap kecepatan alir	Sensitivitas suhu
Absorbsi UV	Spesifik	2 x 10^-16	Tidak	Rendah
Absorbsi IR	Spesifik	10^-6	Tidak	Rendah
Flourometri	Spesifik	10^-11	Tidak	Rendah
Indek bias	Umum	1 x 10^-7	Tidak	+ 10^{-4 0}C
Konduktometri	Spesifik	10^-8	Ya	2% ⁰C
Spektometri massa	Umum	10^-10	Tidak	Tidak ada
elektrokimia	Spesifik	10^-12	Ya	1,5% ⁰C

D. Prinsip kerja HPLC

Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.

HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

E. Prinsip Dasar HPLC

Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan

senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan

fase stasioner (diam). Fase mobilenya adalah sampel dan eluen yang bercampur, dan

fase stasionernya adalah silika gel yang mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa

yang memiliki kepolaran yang lebih tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang

bersifat polar.

F. Perawatan HPLC

Efisiensi pemisahan kolom HPLC tidak hanya tergantung pada kualitas kolom, namun juga pada bagaimana kolom digunakan secara umum, kolom yang sering digunakan adalah Silika. Kestabilan mekanik yang besar, sangat baik sifat permukaan fisikokimia, berbagai ikatan kimia, dan kompatibel dengan berbagai pelarut organik.

Berikut beberapa cara perawatan HPLC agar tetap dapat digunakan secara efisien.

· Stabilitas pH

kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika mengukur nilai pH, pengukuran harus dilakukan dalam media air sebelum mencampur eluen dengan pelarut organik. HPLC kolom dapat digunakan di luar rentang pH. Ikatan kimia baru yang memungkinkan penggunaan sampai pH 1 untuk beberapa fasa diam. Fase stasioner didasarkan pada silika gel ultra murni juga dapat digunakan pada rentang pH yang lebih tinggi, sampai untuk pH 11, tergantung pada sifat kimia pengubah yang digunakan dalam fase gerak. Basis Besar (seperti Pyrolidine) tidak mampu menyerang permukaan silika dan oleh karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi.

· Teknik Stabilitas

Fase stasioner didasarkan pada silika secara mekanik sangat stabil, dikemas dalam kolom yang menunjukkan tidak ada batas tekanan, dan dapat digunakan di lebih dari 40 MPa (6000 psi) tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran dalam kolom, yang menghasilkan puncak membelah pada kromatogram

· Eluen

Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi ireversibel dari kotoran pada kolom. Kotoran ini memblokir situs adsorpsi, mengubah selektivitas kolom dan mengarah ke puncak memisahkan di kromatogram tersebut.

· Penyimpanan Kolom

o Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat disimpan dalam eluen yang digunakan dalam terakhir analisis.

o Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, kolom harus dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.

o Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut harus dapat disimpan dalam pelarut aprotik. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik adalah pelarut Asetonitril.

G. Kegunaan HPLC

Beberapa kegunaan dari HPLC :

· HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.

· Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

· Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

· Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.

· Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.

· Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

· Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

H. Kelebihan dan Kekurangan HPLC

Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:

· Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi.

· Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.

· Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.

· Kolom dapat digunakan kembali.

· Waktu analisa cukup singkat.

· HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.

· Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.

· Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

· Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.

· Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.

· Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

I. Contoh Percobaan

· Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa (Obat) Dalam Campuran

HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

· Penggunaan KCKT dalam bidang farmasi

Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk menetapkan kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati .Hal ini disebabkan KCKT merupakan metode yang memberikan sensitifitas dan spesifitas yang tinggi. Berikut ini adalah beberapa contoh penggunaan KCKT untuk analisis beberapa sediaan farmasi :

Obat (sediaan)	Fase diam	Fase gerak	Detektor
Adriamisin (serum)	C₁₈	Asetonitril-asam fosfat 0,01 N ph 2,3 (50:50)	Fluoresen EK : 465 nm EM : 580 nm
Aktinomisin (Serbuk)	C₁₈	CH₃CN-H₂O (1:1)	Elektrometer
Allopurinol (tablet)	C_18;4 x 30 cm	KH₂PO₄0,05M; 1,5 ml/menit	UV 254 nm

o Parasetamol:

§ Nama Kimia : 4- Hidroksiasetanilida

§ Rumus Molekul : C₈H₉NO₂

§ Berat Molekul : 151,16

§ Pemerian : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit.

§ Kelarutan : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut dalam etanol. (Depkes RI, 1995).

Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan derivat para-amino fenol yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik. Asetaminofen merupakan pengganti yang baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan keluhan saluran cerna dan pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang tidak menguntungkan. Asetaminofen merupakan analgetik dan antipiretis.

Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik.

Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan.

Diawali dengan menginjeksikan sampel uji yaitu larutan obat yang sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom HPLC dengan injektor khusus / syringe yang bervolume 20 µL, penyaringan sebelum penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan menghilangkan gas dari pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui kolom dengan bantuan pompa bertekanan tinggi.

Di dalam kolom, komponen- komponen pada sampel dipisahkan berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. Solut yang interaksinya kurang kuat akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut lainnya. Komponen akan keluar dari kolom dengan kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan adalah detektor UV karena parasetamol merupakan senyawa organik yang dapat menyerap sinar UV.

Pengujian ini menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan panjang gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu 190 nm. Teknik yang dilakukan kali ini merupakan “reverse phase” atau fasa terbalik karena teknik ini menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa diamnya menggunakan pelarut non- polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam yang berbeda kepolarannya ini bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan fasa diamnya saat melewati kolom HPLC. Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk melewati kolom ini disebut waktu retensi.

Dalam pengujian parasetamol dalam obat, waktu retensi yang terukur adalah antara 2,19 hingga 2,2. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini menghasilkan suatu citra berupa kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara intensitas komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Seharusnya tampilan kromatogram ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar dan tidak simetris tentunya. Ini disebabkan antara lain oleh adanya difusi didalam kolom HPLC, difusi yang terjadi adalah difusi longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu sendiri disebabkan oleh penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer massa disebabkan oleh kecepatan komponen yang tidak merata.

Terdapat beberapa parameter pemisahan dalam HPLC, yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner kolom C-18 yaitu 15 cm, ukuran partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas. Parameter- parameter ini dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti pelebaran pada puncak. Adanya pelebaran puncak pada kromatogram mengindikasikan terjadinya overlapping analit yang belum terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju difusinya maka komponen dalam sampel akan semakin sulit dipisahkan secara efisien. Dari grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat dihitung kadar parasetamol dalam sampel obat. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh kadar parasetamol sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-rata tablet obat sebesar 738,2 mg diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg. Dapat disimpulkan bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98 mg per tabletnya.

o Kafein

Rumus struktur :

§ Nama Kimia : 1,3,7-Trimetil xantin

§ Rumus Molekul : C₈H₁₀N₄O₂

§ Berat Molekul : 194,19

§ Pemerian : serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih, biasanya menggumpal, tidak berbau, rasa pahit.

§ Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform, sukar larut dalam eter. (Depkes RI, 1995).

Dalam penetapan kandungan kafein digunakan sampel berupa minuman berkafein. HPLC yang digunakan adalh jenis HPLC Series 200 dengan detector 275 nm Perkin Elmer, Kolom : Supelcosil LC : 18, ( 25 cm X 4,6mm, 5 μm ). Menggunakan asam asetat 70% dan methanol 30% sebagai fasa gerak. Proses pengerjaan terdiri dari 2 tahap, yaitu tahap preparasi dan tahap injection ke HPLC.

· ANALISIS KUANTITATIF

o Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak

Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif diasumsikan bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan kadar / konsentrasi zat yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling sederhana diukur lebar atau tinggi Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau tinggi Puncak diekspresikan sebagai suatu persentase dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi puncak memberikan komposisi dari campuran yang dianalisis, seperti contoh pada Tabel berikut:

No	Peak area
No	Kafein standar	Kafein dalam sampel
1	2601417,40	2216635,31

Berdasarkan data table diatas, maka kadar kafein dalam sampel ( teh poci ) dapat dianalisis dengan mengunakan persamaan :

Cx = Ax / Ap X Cp

= x 200 ppm

= 170,42 ppm

Maka dalam 1 mL sampel yang diuji terdapat 0,17042 mg kafein.

Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu:

Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada kromatogram. Komponen-komponen dapat berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom, atau, terelusi tanpa terdeteksi. Kita harus mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk setiap komponen

Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.

Kafein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar dan mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi otak dan suasana jiwa diperbaiki. Kofein juga memperkuat kontraksi jantung, vasodilatasi perifer dan diuretis. Kofein digunakan sebagai penyegar. Zat ini sering dikombinasikan dengan Parasetamol atau asetosal untuk memperkuat efek analgetisnya.

Kafein dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi. Dosis tinggi diperlukan untuk memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi. Dosis letal sekitar 10 g (kira-kira 100 cangkir kopi) yang menimbulkan aritmia jantung. Kematian karena kafein sangat tidak mungkin. Letargi, iritabel dan sakit kepala terjadi pada pengguna yang secara rutin minumg lebih dari 600 mg kopi per hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari) dan mendadak berhenti. (Mycek, 2001).

o Preparasi Sampel

1. Sampel harus dalam bentuk larutan

2. Untuk skala analisis sampel dalam mikroL , konsentrasi sampel yang diinjeksikan tidak boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom.Konsentrasi maksimal adalah 40 ppm.

o Preaparasi Fase Gerak

1. Fase Gerak ( eluen ) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC. Untuk air digunakan akuabidest.

2. Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan milipore kemudian diawagaskan ( di digest ) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk menghilangkan udara terlarut.

3. Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan untuk menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.

4. Tabung eluen yang diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang di gunakan.

J. Analisis Kromatogram/ interpretasi data

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan

Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector, pengolahan data.

Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu campuran.

HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas.

B. Saran

Pada saat praktek menggunakan alat HPLC perlu adanya kerjasama antara praktikan dan pembimbing agar praktikan dapat memahami dan mampu menggunakan alat dengan baik dan benar.

DAFTAR PUSTAKA

· http://kimia40.blogspot.com/2016/10/makalah-kromatografi-cair-kinerja.html

· http://indonesiakimia.blogspot.com/2011/05/high-performance-liquid-chromatography.html

· https://aryadhede.blogspot.com/2016/08/v-behaviorurldefaultvmlo.html

· http://pelatihanlaboratorium.com/perawatan-kolom-hplc-dan-gc/